прозрачных питательных сред, позволяющих получать более полную информацию
об особенностях колонии. Использование сред с локальными источниками НАД
даёт важную информацию на первом этапе бактериологического исследования о
НАД -зависимости, а в случае кровяного агара - также о гемолитической
активности бактерий. Применение питающих бактерий как источника НАД требует
отвивки культур в течении 24-48 часов из-за быстрой их гибели под влиянием
метаболитов «баккормилок». Подращивание материала в течении 6-8 часов в
сывороточно - дрожжевом бульоне, содержащем бацитрацин, с последующим
рассевом на среды увеличивает вероятность выделения культур НАД--зависимых
бактерий.
Для поддержания культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae при текущей
работе в наибольшей степени подходят оптимальные плотные питательные среды
с заливкой культур вазелиновым маслом при температуре хранения 5-8(С.
Наиболее длительно сохраняют жизнеспособность (6-7 недель) культуры,
выращенные в сгустках крови и сохраняемые в замороженном состоянии.
2.1.2. Методы и результаты идентификации НАД--зависимых бактерий,
выделенных от свиней, по культурально - морфологическим, ферментативным и
генетическим свойствам.
Исследование ферментативных свойств НАД – и гемин – зависимых культур
бактерий проводили на рутинных дифференциально-диагностических средах с
добавлением ростовых факторов, а также на жидких средах Гисса в
микрообъёмах и диагностических системах ПБДЭ и СИБ Горьковского НИЭМ.
Максимальное совпадение результатов было получено на общепринятых средах, в
ПБДЭ и микрообъёмах.
Таксономическое положение 165 культур НАД--зависимых бактерий,
выделенных от клинически здоровых свиней, а также животных с явлениями
фибриозно-геморрагической плевропневмонии или генерализованных серозитов,
было исследовано при помощи нумерического анализа. В качестве опорных в
данную коллекцию культур были включены типовые штаммы Haemophilus
(Actinobacillus) pleuropneumoniae, H.parasuis, H.parainfluenzae,
H.influenzae, A.ligieresii, A.suis. У каждого исследованного штамма были
определены 57 фенотипических признаков, характеризующих их культуральные и
ферментативные свойства. Все полученные данные были преобразованы в
числовую форму, подвергнуты нумерическому анализу свиноводства конечным
представлением полученных результатов в виде дендрограммы.
Анализ дендрограммы показал, что все культуры объединяются в единый
массив при уровне сходства 75,02%, после чего они подразделяются на два
больших фенона: один с уровнем сходства 81,87%, включающий типовые штаммы
A.lignieresii, A.suis, Haemophilus, (Actinobacillus), pleuropneumoniae и
типовой штамм «малой группы» (фенон «А»), второй с уровнем подобия 81,997%
включает типовые штаммы H.influenzae, H.parainfluenzae и H.parasuis (фенон
«Н»). Из фенона «А», объединяющего культуры актинобацилл на уровне подобия
91,23%, выделяется фенон №1, включающий виды A.lignieresii и A.suis, и на
уровне сходства 95,00% выделяется фенон №2, объединяющий эпизоотические
культуры вокруг типового штамма «малой группы». При уровне подобия 89,48%
формируется фенон №3, объединяющий эпизоотические штаммы вокруг типовых
культур Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.
В феноне «Н» на уровне сходства 81,997% выделяется фенон №4-
-H.influenzae, на уровне 87,63% - фенон №5, объединяющий штаммы
H.parainfluenzae и на уровне подобия 89,60% вокруг типовых штаммов
H.parasuis концентрируется другая группа эпизоотических штаммов -
-фенон №6.
Следовательно, массив эпизоотических штаммов дифференцируется на три
фенотипические группы, соответствующие видам Haemophilus (Actinobacillus)
pleuropneumoniae, H.parasuis и «малой группе» гемофильных бактерий.
Полученные данные свидетельствуют о тяготении культур Haemophilus
pleuropneumoniae не к роду Haemophilus, а к роду Actinobacillus.
С целью уточнения таксономического положения эпизоотических штаммов,
классифицированных по фенотипическим свойствам как Haemophilus
(Actinobacillus) pleuropneumoniae, НАД--зависимых бактерий, обозначаемых
как Pasteurella-haemolytica- подобные бактерии, был определён нуклеотидный
состав и уровень гомологии ДНК культур этих групп свиноводства
представителями рода Haemophilus (H.parasuis, шт.J 95-таксон «С»),
Pasteurella (P.multocida), Actinobacillus (A.suis), а также с типовыми
культурами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.
Результаты показали, что все исследованные штаммы по ГЦ -составу
образуют довольно однородную группу свиноводства крайними значениями 39,8 -
43,2 ([pic]=41,3(0,2). Такие значения вполне соответствуют приводимым в
Руководстве Берги для семейства Pasteurellaceae. Несколько более высокий ГЦ
состава обнаружен у P.haemolytica - подобных бактерий (42,5(0,5) по
сравнению с типовыми штаммами A.pleuropneumoniae, (40,7(0,5).
Эпизоотические штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae имели
показатель 41,2(0,1 мол% ГЦ.
Уровень гомологии ДНК внутри группы P.haemolytica - подобных штаммов
составил 100%; ДНК бактерий этой группы (шт.2288/77) имела гомологию с ДНК
типовых штаммов A.pleuropneumoniae - 75%; с ДНК A.suis - 33%, с ДНК
P.multocida и H.parasuis не более 9%; с ДНК эпизоотических штаммов
Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae - 75—83%.
Эпизоотические штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae
по данным гибридизации ДНК образуют генетически взаимосвязанную группу с
уровнем подобия нуклеотидных последовательностей – 75-100%. В то же время
бактерии этой группы тесно связаны с типовыми штаммами Haemophilus
(Actinobacillus) pleuropneumoniae (78-98%), на уровне 33-38% гомологичных
нуклеоидных последовательностей с ДНК A.suis , и только на уровне гомологии
ДНК 5-9% с H.parasuis и 3-10% c P.multocida.
При интерпретации полученных результатов мы исходили из критериев
генетического анализа, предложенных Медниковым и соавт.(1974), согласно
которым культуры P.haemolytica - подобных бактерий не имеющие
НАД—зависимости, могут рассматриваться как биовар Haemophilus
(Actinobacillus) pleuropneumoniae. В целом эпизоотические штаммы,
выделенные при фибринозно - геморрагических пневмониях, P.haemolytica -
подобные бактерии и типовые штаммы Haemophilus (Actinobacillus)
pleuropneumoniae предстают как видовая общность с заметной внутривидовой
гетерогенностью. Подобный внутривидовой уровень гетерогенности не исключает
выделения дополнительных внутривидовых таксонов, кроме НАД—зависимого и -
независимого биоваров.
Полученные данные свидетельствуют, что культуры A.pleuropneumoniae,
обозначаемые в 9-м издании Руководства по систематике бактерий Берги как
видов рода Haemophilus, не относятся к нему, а также штамм J95 (таксон
«С»), упоминаемый в числе видов рода Haemophilus, по данным гибридизации
также не относится к роду Haemophilus.
На основании результатов нумерического анализа, с учётом частоты
встречаемости тех или иных положительных ферментативных реакций, для
идентификации НАД--зависимых бактерий, выделяемых при пневмониях и
генерализованных серозитах свиней, рекомендованы в качестве основных
дифференциальных признаков (кроме культуральных): НАД—зависимость,
образование уреазы, щелочной фосфатазы, гемолизина, кислоты из ксилозы,
маннита и маннозы. Остальные ферментативные признаки можно рассматривать
как дополнительные.
Потеря культурами A.pleuropneumoniae НАД—зависимости и признание
существования НАД—независимого биовара этого вида бактерий делает
неприемлемой схему идентификации, предлагаемую для НАД--зависимых культур.
Неизбежно расширяется число бактериальных видов, от которых необходимо
дифференцировать НАД - независимые культуры A.pleuropneumoniae. Ситуация
осложняется тем, что сходные патологоанатомические изменения в лёгких могут
вызвать другие виды бактерий. В опытах экспериментального (интраназального)
заражения свиней сходные изменения в легких были обнаружены при инокуляции
культур A.pleuropneumoniae НАД—зависимого и - независимого биоваров, A.suis
и бактерий «малой группы». Данное обстоятельство увеличивает значение
бактериологического исследования в диагностике болезни. Сравнительное
изучение физиологических свойств A.pleuropneumoniae (1 и 2 биовары),
A.suis, P.multocida и B.bronchiseptica как видов сходных и достаточно часто
обнаруживаемых при пневмониях свиней позволило нам отобрать для их
дифференциации следующий минимальный набор признаков: липкость колоний и
вязкость бульона, наличие капсулы и жгутиков, гемолитическая и уреазная
активность, образование щелочной фосфатазы, индола, кислоты из маннита,
сорбита, салицина, мелибиозы, утилизации цитратов.
3. Патогенные свойства A.pleuropneumoniae.
Исследовали патогенность данного вида бактерий для лабораторных
животных и свиней.
При испытаниях различных способов заражения морских свинок культурами
A.pleuropneumoniae животные этого вида оказались наиболее чувствительны
культур интраназальной инокуляции (ЛД50=125млн.м.к.), менее чувствительны –
к внутрибрюшинному (ЛД50=1,585 млрд.м.к.) и малочувствительны к подкожному
заражению. Сравнительная оценка вирулентности девяти штаммов
A.pleuropneumoniae при интраназальном способе инокуляции по критерию объёма
поражённой лёгочной ткани показала наибольшую вирулентность культур 1,4,5
сероваров и существенно меньшую у культуры серовара 3; культуры серовара 2
показали штаммовые различия. Патологоанатомические изменения при
интраназальном заражении морских свинок характеризовались развитием
фиброзно-геморрагической пневмонии.
В отличие от морских свинок белые мыши оказались более чувствительны
к внутрибрюшинному заражению: ЛД50 составила для культуры [pic] [pic] [pic]
изменения в лёгких у заражённых мышей характеризовались развитием
геморрагической пневмонии. Отличительной особенностью явилось практически
полное отсутствие отложений фибрина на плевре и перикарде. В целом
прослеживается видовые отличия изменений в лёгких при актинобациллёзной
пневмонии: в воспалительном экссудате максимальное количество фибрина
отмечается у свиней, меньше - у морских свинок и практически отсутствует у
мышей.
Полученные результаты свидетельствуют, что морские свинки и белые
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
