Однако не все переносчики работают столь медленно. Анионный переносчик белок полосы 3 из эритроцитарной мембраны играет важную физиологическую роль в усилении быстрого трансмембранного обмена С1" на НС03~. Одна из функций эритроцитов заключается в усилении транспорта СОг от различных тканей к легким. В венозных капиллярах СОг быстро диффундирует через эритроцитарную мембрану. В клетке под действием карбоангидразы СОг превращается в Н2СО3, затем быстро устанавливается равновесие Н2СО3 Н + + НС03~, и анион бикарбоната переносится через мембрану в плазму крови белком полосы 3. В результате по мере того, как эритроцит проходит по капиллярам, концентрация НС03~ в плазме увеличивается, причем этот процесс занимает меньше 1 с. Когда кровь достигает легких, начинается диффузия СОг в атмосферу. При этом под действием карбоангидразы в эритроцитах происходит массовое превращение Н2С03 в СОг и НгО. Этот процесс в свою очередь является движущей силой для переноса аниона бикарбоната внутрь эритроцита, где он быстро превращается в СОг и НгО.

Транспортная система должна функционировать очень быстро, но в отличие от ионных каналов в аксонах здесь нет нужды в электрогенных реакциях, которые только замедлили бы быстрый массовый транспорт. Но транспорт катиона, например Na +, вместе с НС03~был бы нежелателен, поскольку изменение концентрации соли в эритроците привело бы к осмотическому дисбалансу. Эта проблема решается с помощью антипортера, который в обмен на каждый транспортируемый ион НС03~ переносит в обратном направлении анион С1". Такая челночная система работает очень быстро, с числом оборотов 105 с1, что немногим меньше скорости переноса ионов настоящим каналом.

Дополнение 8.1. Время электрического ответа мембраны

Время электрического ответа т является мерой того, как быстро трансмембранный потенциал достигает нового равновесного значения после открывания специфических ионных каналов. В возбудимых мембранах этот параметр является ключевым и определяется емкостью

мембраны С и удельным сопротивлением R. Получим выражение для т.

Начнем с того, что продифференцируем по времени уравнение для емкости:

dQ/dt равно току / и равно нулю, когда напряжение достигает своего конечного значения Ук. Ток через ионный канал пропорционален разности между истинным напряжением и напряжением, определяемым из уравнения Нернста для равновесного состояния при нулевом потоке. В соответствии с законом Ома / = /R. Отсюда

Решение уравнения имеет вид

или где т = RC.

Напряжение на мембране растет экспоненциально от нуля до конечного значения 100 мВ с постоянной времени т, равной RC. Следовательно, произведение удельного сопротивления мембраны R на емкость С имеет размерность времени и характеризует время электрического ответа мембраны. Предположим, что в мембране открыто 50 каналов на 1 мкм2. Это значит, что удельная проводимость мембраны составляет 10 мСм/см2 и удельное сопротивление мембраны соответственно равно 100 Ом см2. В этом случае RC = 0,1 мс, что находится в интервале значений, характерных для возбудимых мембран зависит главным образом от удельного сопротивления мембраны, поскольку емкость определяется в основном липидным би-слоем.

Обратите внимание, что удельное сопротивление мембраны зависит от числа каналов, времени, в течение которого они открыты, и проводимости каждого канала в открытом состоянии. С разработкой методов, позволяющих реконструировать работу одиночных каналов, появилась возможность прямо измерить эти параметры.

КАНАЛЫ И ПЕРЕНОСЧИКИ КАК ФЕРМЕНТЫ: ПРИМЕНЕНИЕ ТЕОРИИ СКОРОСТЕЙ

Кинетическую теорию переходного состояния Эйринга, используемую энзимологами, успешно применяют и в случае различных траспортных систем. В основе этого подхода лежит предположение о том, что система может находиться в нескольких дискретных состояниях, каждому из которых соответствует стандартное значение электрохимического потенциала. При этом взаимные переходы между двумя состояниями сопряжены с переходом системы через промежуточные стадии с более высокой свобод-

ной энергией, и константы скоростей переходов зависят от высоты соответствующих энергетических барьеров. Минимумы на кривых изменения свободной энергии соответствуют местам связывания транспортируемых веществ. Можно предположить, что канал или переносчик имеет одно или несколько мест связывания переносимых веществ. При достаточно высоких концентрациях переносимого вещества все эти места оказываются занятыми и скорость переноса достигает своего максимального значения Утлх, равного максимальной скорости работы фермента. Экспериментальные подтверждения этому получены для всех переносчиков и для многих каналов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы каналов

Применим теорию переходного состояния для анализа работы ионного канала в случае, когда ионы изначально присутствуют только с одной стороны мембраны. Примем» для простоты, что внутри канала имеется единственное место связывания и что ионы не могут свободно проникать внутрь канала или покидать его. Если внутри канала имеется много мест связывания, по которым ион может последовательно передаваться, то скорость переноса будет по-прежнему описываться уравнением Михаэлиса-- Ментен. Если принять, что трансмембранное напряжение равно нулю, то «реакцию» можно представить следующим образом:

где Е -- это канальный белок в «открытом» состоянии, Si и So -- транспортируемое вещество внутри и снаружи, ES -- комплекс субстрата с местом связывания внутри канала. На рис. 8.1 показан профиль свободной энергии для такой модели. Приведен также профиль для канала в закрытом состоянии. Прохождению иона через канал препятствует увеличение высоты одного из энергетических барьеров, но каков механизм этого процесса, пока неизвестно, за исключением, возможно, канала щелевого контакта. Закрывание канала может быть обусловлено, например, изменением положения а-спирали или только боковой цепи, в результате чего эффективно блокируется транспорт ионов через канал.

Применение критерия стационарного состояния дает уже знакомое уравнение Михаэлиса--Ментен для скорости:

„ к-, + k2 rc.

где Км = - , о -- суммарная концентрация переносчика.

Рассмотрим два случая: 1) насыщающая концентрация субстрата, > Км\ 2) низкая концентрация субстрата, < А"м.

1. Насыщающая концентрация субстрата. В этих условиях все места связывания заняты и скорость переноса достигает своего максимального значения, определяемого высотой энергетического барьера для выхода из канала. Это легко увидеть, преобразовав уравнение Михаэлиса -- Ментен для случая > Км:

2. Низкая концентрация субстрата. При < Км наблюдается линейная зависимость скорости от концентрации субстрата, т.е. имеет место кинетику второго порядка. Кажущуюся константу скорости второго порядка можно получить, преобразовав уравнение Михаэлиса--Ментен для случая малых:

Полученное уравнение достаточно важно, поскольку оно описывает работу большинства, если не всех ионных каналов. Кажущаяся константа скорости второго порядка для этой реакции равна к2/Км-Даже для столь простого случая это не истинная микроскопическая константа скорости, а комбинация констант скоростей.

Из этой простой модели следует несколько выводов.

1. Измеряемая константа скорости, которая определяет скорость транспорта по открытому ионному каналу, содержит информацию о кажущемся сродстве иона к месту связывания и о числе оборотов. В отсутствие напряжения на мембране эта константа скорости прямо связана с проницаемостью, обусловленной единичным каналом. Если внутренний барьер мал, то константа скорости транспорта будет равна ki -- константе скорости второго порядка для иона, входящего в канал. Лимитирующим фактором для этой реакции может служить диффузия, при этом к\ будет составлять 10--109M"'c_l. Если внутренний энергетический барьер велик, то константа скорости транспорта будет равна произведению -кг-

2. Зависимость скорости транспорта от напряжения определяется проводимостью. Это легко понять, если посмотреть, как падение напряжения на мембране влияет на индивидуальные микроскопические константы. Если на профиль потенциала, изображенный на рис. 8.1, наложить прямую, отвечающую линейному падению напряжения на мембране, то высота энергетических барьеров, отвечающих кг и к\, уменьшится, а к - i -- увеличится. В результате этого существенно увеличится константа скорости второго порядка для ионного транспорта, что и следовало ожидать. Простые модели типа рассмотренной нами не предсказывают линейной зависимости тока от напряжения, наблюдаемой экспериментально. Однако при введении в такие модели дополнительных энергетических барьеров кривая зависимости потока от напряжения становится очень близкой к линейной.

3. Ионную селективность можно объяснить несколькими путями. Селективность -- это способность канала пропускать некоторые ионы лучше, чем другие; ее можно количественно охарактеризовать как отношение проницаемостей или проводимостей для сравниваемых ионов. Поскольку в выражение для константы скорости транспорта входят как ки так и к2, то причиной селективной ионной проводимости может служить как более низкий энергетический барьер на входе в канал, так и более низкий барьер для перемещения внутри канала для определенного типа ионов. Например, если у входа в канал имеются отрицательные заряды или диполи, то скорость транспорта анионов может уменьшиться, т. е. канал окажется катионселективным. Такая картина наблюдается для нескольких рецепторных канальных белков и грамицидина А. Размеры переносимых веществ также влияют на скорость транспорта. Если размер молекулы переносимого вещества больше, чем диаметр канала, то это вещество не сможет попасть в канал. И наконец, селективность может быть связана с различием в скоростях переноса разных ионов внутри канала. Например, в случае Na+-селективного канала энергетический барьер для переноса этого иона внутри канала существенно ниже, чем для других ионов, таких, как К+, что ведет к увеличению проводимости no Na+. Представляется маловероятным, чтобы причиной ионной селективности было увеличение сродства иона к каналу. Такое изменение, соответствующее увеличению глубины впадины на профиле потенциала, должно было бы приводить к уменьшению скорости выхода иона из канала, т. е. к уменьшению максимального потока через канал, а также к уменьшению концентрации иона, необходимой для насыщения канала, т. е. к уменьшению Км. Около значения Км для тех каналов, которые преимущественно пропускают Na+ или К +, достаточно высоки, 200--300 мМ, что выше обычных физиологических концентраций этих ионов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы переносчиков

Обратимся теперь к переносчикам. Рассмотрим простой переносчик с одним местом связывания, транспортирующий молекулы через мембрану. Рис. 8.2 иллюстрирует основные свойства как первичного активного переносчика, так и пермеазы. Рассмотрим четыре состояния белка-переносчика: 1) белок обращен внутрь/связан с субстратом; 2) обращен внутрь/не связан; 3) обращен наружу/ связан с субстратом; 4) обращен наружу/не связан. Тогда транспорт можно представить в виде следующей последовательности элементарных обратимых стадий.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10