Происходит конформационное изменение, существенно уменьшающее кинетический барьер для перемещения иона к выходу из канала и увеличивающее энергетический барьер для движения в обратном направлении. Это конформационное изменение может быть спонтанным или может происходить с потреблением энергии. Участок переносчика со связанным субстратом оказывается теперь обращенным к противоположной стороне мембраны.
Субстрат высвобождается из комплекса с переносчиком и выходит на противоположной стороне мембраны. Для активных переносчиков сродство субстрата к белку ниже, когда место связывания обращено к /иронс-стороне мембраны.
Происходит конформационное изменение, возвращающее белок-переносчик к исходной конформации, в которой место связывания вновь обращено к j/ис-стороне.
Ключевым моментом в работе всех переносчиков является наличие высокого энергетического барьера, для преодоления которого соответствующие белки должны претерпеть конформационные изменения. Если для этого необходима энергия, то система может работать как активный переносчик. Если для конформационного перехода необходимо, чтобы молекула переносимого вещества была связана с белком, т. е. стадия 4 отсутствует, то белок будет катализировать только обмен вещества через бислой, поскольку он не может изомеризоваться в «незагруженной» форме.
Для описания работы ионных каналов и различных видов
переносчиков разработано много моделей и схем. Хотя кинетическая теория переходного состояния имеет определенные ограничения, особенно в том, что касается кинетических свойств каналов, ее применение упрощает решение многих сложных задач и позволяет единым образом подходить к рассмотрению различных транспортных механизмов.
АНАЛИЗ СТАЦИОНАРНОГО СОСТОЯНИЯ
Для кинетической характеристики транспортных систем, которые катализируют облегченную диффузию или активный транспорт, могут использоваться различные подходы к анализу стационарного состояния. Все эти подходы основаны на измерении скорости переноса растворимых веществ через мембрану, но при разных условиях. В качестве примера мы рассмотрим эксперименты, которые проводились на пермеазах и мембранных везикулах. Обычно для такого рода измерений используют радиоактивные метки. Ключевым моментом является то, что пермеаза должна не только переносить вещество через бислой, то также и возвращаться обратно. Скорость транспорта может зависеть от любой из этих стадий. Опишем вкратце некоторые подходы к анализу.
Субстрат присутствует только с одной стороны мембраны. Начальная скорость транспорта измеряется для однонаправленного потока. Обратите внимание, что для обеспечения постоянного потока транспортируемого вещества переносчик должен вернуться свободным. Измеряют поток как функцию для процесса, протекающего в любом направлении.
Равновесный обмен. Субстрат присутствует в одинаковой концентрации с обеих сторон мембраны, но радиоактивная метка -- только с одной стороны. В этом случае пермеаза может возвращаться, будучи связанной с немеченым веществом. Измеряют поток как функцию.
Меченый субстрат нахоится с цис-стороны мембраны, а в насыщающей концентрации он присутствует на противоположной стороне. Измеряют поток как функцию ^uc. Как и в первом случае, при этом регистрируют однонаправленный поток. Такой поток называют также встречным, поскольку меченое вещество переносится против своего химического градиента.
Удельная радиоактивность субстрата с обеих сторон мембраны одинакова. В насыщающей концентрации субстрат находится на транс-стороне, a „uc изменяется. В этом случае измеряют суммарный перенос, поскольку радиоактивное вещество пересекает мембрану в обоих направлениях. При таких условиях измерения состояние системы близко к равновесному.
Во всех случаях определяют Ктах и Км, которые при этом не обязательно совпадают для разных подходов. Для разных моделей можно получить кинетические уравнения для стационарного состояния и проверить их. Как и в классических работах по энзимо-логии, очень полезным может оказаться использование ингибиторов. При этом ингибиторы можно вводить с любой стороны мембраны, что позволяет получить дополнительную информацию.
Такого рода подходы можно применять при работе с клетками, субклеточными мембранными везикулами или искусственными реконструированными системами. Для исследования работы ионных каналов обычно применяют электрические методы, которые дают огромные преимущества.
Дополнение 8.2. Исследование транспорта в стационарном состоянии с использованием мутантной лактоэопермеазы из Е. coll
Как пример использования описанных выше подходов рассмотрим изучение транспорта в стационарном состоянии, осуществляемого одной из мутантных форм лактоэопермеазы, в которой остаток Glu в положении 325 заменен на Ala. На рис. 8.11 этот остаток находится в спирали 10. При измерениях использовали радиоактивную лактозу, при этом накопление лактозы изучали на интактных клетках, а выведение, встречный поток и обмен лактозы -- на цитоплазматических мембранных везикулах с правильной ориентацией. Пермеаза дикого типа катализирует сим-порт /3-галактозидов и Н+. В присутствии протонного электрохимического градиента пермеаза использует свободную энергию, высвобождающуюся при переносе Н + по градиенту, для накопления /3-галактозидов против концентрационного градиента.
При замене остатка Glu-325 на Ala активный транспорт лактозы прекращается. Для измерения накопления лактозы использовали интактные клетки, в которых пермеаза дикого типа была заменена мутантной пермеазой. Для этого к суспензии дышащих клеток добавляли -лактозу и измеряли количество лактозы, накапливаемой клетками, в зависимости от времени. Приблизительно через 3 мин перенос лактозы достигал максимальной величины, но в клетках с мутантной пермеазой оставался пренебрежимо малым. Для изучения выведения лактозы инкубировали мембранные пузырьки в течение нескольких часов в присутствии высоких концентраций радиоактивной лактозы, а затем аликвоты переносили в среду без лактозы. Быстро фильтровали везикулы, измеряли их радиоактивность с помощью сцин-тиляционного счетчика и определяли скорость потери лактозы везикулами. Время полувыведения для контрольных везикул составляло 10 с, а для пузырьков, содержавших мутантную пермеазу, оно было равно 540 с. Мутантная пермеаза неспособна транспортировать лактозу как в прямом, так и в обратном направлениях.
Совершенно другие результаты были получены, однако, при измерении равновесного обмена. Эти измерения проводят точно так же, как и измерения по выведению лактозы, только нагруженные лактозой везикулы помещают в среду, содержащую немеченую лактозу в такой же концентрации. В этих опытах скорости выведения -лактозы из везикул, содержавших в одном случае пермеазу дикого типа, в другом -- мутантную, были идентичными. Эти эксперименты показывают, что, хотя мутантная пермеаза не может осуществлять полный цикл транспорта лактозы, она способна изо-меризоваться в загруженную форму, что делает возможным трансмембранный обмен лактозы. Сходным образом мутантная пермеаза нормально функционирует в опытах по измерению встречного потока. При таком подходе везикулы нагружают немеченой лактозой, разводят средой, содержащей -лактозу в низкой концентрации, и измеряют поток меченой лактозы внутрь везикул. Этот подход также показал, что связанная с лактозой форма пермеазы нормально изомеризуется и осуществляет трансмембранный обмен лактозы.
Приведенные выше данные позволили сделать вывод о том, что мутантная пермеаза, содержащая А1а-325, не может депротониро-ваться. Таким образом, пермеаза оказывается дефектной по всем сопряженным транспортным процессам, в которых Н+ и лактоза переносятся вместе в цикле, требующем наличия депротонирован-ной формы переносчика для изомеризации.
Другие примеры использования такого рода подходов более подробно рассмотрены в отличной книге Штейна.
РЕГИСТРАЦИЯ ТОКА, ПРОТЕКАЮЩЕГО ЧЕРЕЗ ОДИНОЧНЫЙ КАНАЛ: ВСТРАИВАНИЕ В ПЛОСКИЕ МЕМБРАНЫ И МЕТОД ПЭТЧ-КЛАМП
Электрический ток, возникающий при быстром перемещении ионов через канал, можно легко измерить. Например, реконструированный никотиновый ацетилхолиновый рецептор -- химический воротный катионселективный канал в постсинаптических мембранах, открывание и закрывание которого регулируется с помощью химических веществ, -- имеет проводимость в открытом состоянии 45 пСм при концентрации NaCl с одной стороны мембраны 0,5 М. Это -- обычное значение проводимости для ионных каналов. При этом при напряжении на мембране 100 мВ через каждый канал проходит ток 4,5 пА, или 2,7-107 ионов/с. Этот ток легко зарегистрировать с помощью соответствующей электронной аппаратуры. Следовательно, ток через единичный канал можно прямо измерить, если фоновый ток через мембрану достаточно мал. Для того чтобы исследовать свойства индивидуальных канальных молекул, необходимо измерить ток через участок мембраны в условиях, когда одновременно открыто не более одного канала. Для этого можно использовать искусственную систему, когда в плоскую мембрану встроены одиночные канальные белки. Можно также воспользоваться методом пэтч-кламп. В основе метода лежит сделанное в 1979 г. открытие, показавшее, что если чистую стеклянную микропипетку прижать к клеточной мембране и слегка втянуть воздух в пипетку, то на ее конце образуется очень тонкая, но прочная мембранная пленка. Это позволяет получать вольт-амперные характеристики любых каналов, находящихся на этом небольшом участке мембраны. Фоновый ток обычно бывает значительно меньше 1 пА, так что ток через индивидуальный канал можно легко измерить. Применение этой техники произвело настоящую революцию в изучении ионных каналов, позволив детально исследовать работу разнообразных каналов из различных мембран. На рис. 8.3 схематически показаны четыре модификации метода пэтч-кламп. В рамках данного метода можно изменять состав раствора как с одной, так и с обеих сторон мембраны, можно измерять проводимость единичных каналов, изучать энзимологию единичных молекул. Все это делает метод пэтч-кламп необычайно мощным.
Чтобы оценить возможности данного подхода, рассмотрим запись работы единичного ацетилхолинового рецепторного канала, встроенного в бислой. Ворота индивидуальных каналов могут спонтанно открываться и закрываться. Каждое отклонение записи вниз соответствует открыванию канала. Ток, текущий через открытый канал, можно измерить, а это дает возможность определить проводимость единичного канала. Время, в течение которого каждый канал остается открытым, также легко измерить. Получаемое при этом распределение времени жизни канала в открытом состоянии прямо связано с константой скорости закрывания канала. Для самой простой модели, когда имеется одно открытое и одно закрытое состояние,
распределение времени жизни канала описывается экспоненциальной функцией с характерным временем т, равным величине, обратной константе скорости первого порядка для закрывания канала. Когда функция распределения времени жизни канала в открытом состоянии отличается от простой экспоненциальной зависимости, как в случае ацетилхолинового рецептора, для объяснения экспериментальных данных необходимо использовать более сложные состояния. Можно изучать влияние на работу канала различных химических агентов; при этом необходимо отличать влияние этих агентов на кинетические параметры открывания-закрывания каналов от их влияния на проводимость одиночных каналов.
Дополнение 8.3. Определение константы связывания ингибитора по данным о проводимости единичного канала
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
