Несколько примеров пор и каналов
В последнее время достигнуты большие успехи в определении строения пор и каналов на молекулярном уровне. Выявляются некоторые общие структурные элементы этих образований. Анализ аминокислотных последовательностей соответствующих молекул указывает на существование структурно родственных групп ионных каналов. Особенно ценным в этих исследованиях оказался метод реконструкции изображения; с его помощью удалось не только визуализовать отверстия в мембране, создаваемые большими порами, но и выявить симметричную организацию субъединиц вокруг центрального отверстия. Общим структурным мотивом для этих белков может быть цилиндрический канал, формируемый несколькими амфифильиыми а-спиралями разных субъединиц или отдельными доменами одной субъединицы. Впрочем, структура аламетицина и грамицидина А свидетельствует о том, что боковые цепи полярных аминокислот не нужны для формирования полярной внутренней структуры заполненного водой канала. Ни в одном из случаев не доказано достоверно, что кислые остатки непосредственно участвуют в образовании поры. Важным исключением из а-спирального семейства каналов являются пори-яы, поскольку они формируют поры из /3-слоев, а не с помощью а-спиралей.
ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ
Щелевые контакты -- это кластеры мембранных каналов, которые соединяют содержимое соседних клеток в тканях. Через такие каналы проходят небольшие молекулы -- метаболиты и неорганические ионы. Диаметр каналов в клетках млекопитающих составляет от 12 до 20 А. Через иих осуществляется перенос из клетки в клетку ионов и химических веществ. Таким образом, эти каналы соединяют две плазматические мембраны. Опыты по клонированию и биохимической реконструкции показали, что канал образован олигомером единственного пептида, мол. масса которого для клеток печени составляет 32000. Исходя из данных об аминокислотной последовательности, можно предположить, что в каждой субъединице имеются четыре трансмембранные а-спирали. К настоящему времени охарактеризованы белки щелевых контактов из нескольких тканей; по-видимому, они образуют обширную группу родственных белков. Эти каналы обычно находятся в открытом состоянии, но закрываются, когда понижается скорость метаболизма. Первичным сигналом для закрывания канала является, по всей вероятности, повышение концентрации Са2 +, хотя при изменении трансмембранного потенциала или закислении среды также наблюдается закрывание канала. Возможно, эффект Са2+ является опосредованным. Другим способом регуляции работы канала может быть фосфорилирование.
Основная модель, описывающая строение и возможный механизм работы канала, представлена в работе. Для выяснения структуры канала авторы использовали электронную микроскопию. Каждый канал состоит из 12 субъединиц, по шесть от каждой клетки. Канал представляет собой гексамерную структуру с центральной порой. Каждая субъединица имеет форму стержня, пронизывающего бислой. Два гексамерных комплекса соседних мембран соединены конец к концу и образуют протяженный канал, объединяющий обе мембраны. Структура канала щелевого контакта зависит от наличия ионов Са2 +. В присутствии Са2 + субъединицы расположены параллельно центральной оси канала, а в отсутствие этих ионов они несколько наклонены. Это наводит на мысль, что открывание и закрывание канала происходит аналогично работе ирисовой диафрагмы фотоаппарата; субъединицы скользят друг относительно друга в ответ на сигнал к открыванию или закрыванию. Однако точный механизм этого процесса далеко не ясен.
ЯДЕРНЫЕ ПОРОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ
Ядерная оболочка состоит из двух мембран. Ядерные поровые комплексы участвуют в транспорте веществ между ядром и цитоплазмой. Эти поры, аналогично каналам щелевых контактов, пронизывают две мембраны. По данным электронной микроскопии высокого разрешения, ядерная пора имеет октагональную симметрию, но устроена сложнее, чем канал щелевого контакта. Ядерная пора представляет собой два октагональных цилиндра, соединенных вместе наподобие канала щелевого контакта. Полипептидный состав поры ядерной оболочки окончательно не установлен.
Размер поры ядерной оболочки весьма велик, радиус ее функциональной части составляет -- 90 А; через нее могут проходить как небольшие растворимые вещества, так и многие крупные молекулы. Существуют специальные механизмы транспорта макромолекул внутрь ядра и из ядра в цитоплазму, однако до сих пор о них мало что известно.
ПОРИНЫ
Порины образуют поры, которые функционируют как молекулярные сита, опосредуя диффузию небольших гидрофильных молекул через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. Исследование более чем сорока различных поринов позволило выявить некоторые их общие особенности. Мол. масса поринов варьирует от 28 ООО до 48 ООО. В мембране они обычно присутствуют в виде тримеров. Для поринов характерно высокое содержание /3-слоев. Наиболее полно к настоящему времени охарактеризованы порины из Е. coli: OmpF, OmpC, PhoE и LamB. Их основной особенностью является то, что они образуют наполненный водой трансмембранный канал, причем этот канал образован в основном ^-структурными элементами. На рис. 8.7 представлена одна из возможных моделей образования поринового канала из амфифильных, так и по селективности. Селективность связана с наличием внутри канала или около входа в канал заряженных аминокислотных остатков. Измерения проводи-
мости одиночных каналов и проницаемости пор, а также электронно-микроскопические исследования указывают на то, что строение пор не одинаково для разных поринов. В одних случаях тримеры порина образуют один большой канал, в других -- три независимых канала. Канал OmpF имеет три входа с наружной стороны клетки, которые затем сливаются, образуя единый выход в периплазму.
Три из четырех порииов Е. coli имеют много общих структурных особенностей, а их аминокислотные последовательности в значительной степени гомологичны. Эти порины образуют поры диаметром 10--12 A. Четвертый порин, Lam В, значительно отличается от трех предыдущих, хотя его аминокислотная последовательность обнаруживает некоторое сходство с ними. Ои тоже образует главным образом /3-складчатые структуры. LamB является частью системы транспорта мальтозы и обладает сродством к производным мальтозы. В отсутствие мальтозы LamB образует небольшие каналы, которые целиком блокируются при связывании мальтозы. Главной функцией LamB является стимуляция накопления мальтозы, а не работа в качестве диффузионной поры для небольших растворимых веществ. Топографию LamB исследовали с помощью различных методов, включая генетические. В результате была построена детальная модель этого канала, пронизывающего мембрану.
Предположение о том, что порины являются воротными каналами и, значит, могут находиться в закрытом состоянии, подвергалось всесторонней проверке. In vitro работа поринов может регулироваться напряжением на мембране, однако физиологическая значимость этого явления остается неясной.
И наконец, следует отметить, что из наружной мембраны митохондрий были выделены порины, работа которых регулируется напряжением на мембране. Они называются потенциалзависимыми анионселективными каналами. Эти порины не являются родственными бактериальным поринам, но они также рбразуют цилиндрическую пору из /3-структурных элементов
nAChR-канал является примером канала, работа которого регулируется нейромедиатором. Эти каналы находятся главным образом в концевых пластинках -- постсинаптических мембранах нервно-мышечных соединений скелетных мышц. При электрическом возбуждении нейрона из него высвобождается нейромедиатор аце-тилхолин. Последний диффундирует от пресинаптической мембраны нейрона к мембране скелетной мышцы. Никотиновые ацетилхо-линовые рецепторы имеют вид плотно упакованных кластеров в плазматической мембране мышечного волокна, входящей в состав концевой пластинки. При взаимодействии с ацетилхолином канал открывается, опосредуя селективное перемещение катионов. Под действием ионного тока изменяется трансмембранный потенциал и происходит электрическое возбуждение мышечной клетки, что приводит к сокращению мышцы.
nAChR-канал регулируется с помощью химических механизмов, причем сигнал действует непосредственно на канал. Химдческим сигналом является ацетилхолин, который передает возбуждение от нервного волокна к мышце. Анализ аминокислотной последовательности показал, что никотиновый ацетилхолиновый рецептор и два других нейромедиаторных рецептора -- глициновый рецептор и рецептор 7-аминомасляной кислоты -- имеют много общих структурных особенностей. Они образуют группу химически регулируемых каналов. Впрочем, несмотря на сходство аминокислотных последовательностей, эти белки имеют разную четвертичную структуру. Биохимические свойства рецептора глутамата, одного из важных иейромедиаторов головного мозга, не исследованы.
Отметим, что номенклатура и классификация нейромедиатор-ных рецепторов основаны главным образом на данных о влиянии на них различных лекарственных веществ, в особенности тех, которые выступают в роли агонистов, стимулируя рецептор наподобие естественного нейромедиатора, или антагонистов, которые блокируют стимулирующий эффект агонистов. Например, рецепторы ацетилхолина в начале этого века разделяли на никотиновые и мус-кариновые на основании их фармакологических различий. Никотиновые рецепторы ацетилхолина -- это группа родственных рецеп-торных белков. Мускариновый рецептор из клеток мозга структурно не сходен с nAChR-каналом и в действительности не является каналом. Необходимо отметить, что охарактеризованы никотиновые ацетилхолиновые рецепторы из ткани мозга, по некоторым структурным и функциональным особенностям отличающиеся от каналов коицевой пластинки.
По сравнению с другими канальными белками nAChR-канал охарактеризован наиболее полно, и связано это с тем, что существует легкодоступный источник, содержащий большие количества данного белка. Большая часть биохимических экспериментов была поставлена с использованием рецептора, выделенного из электрического органа скатов Eiectrophorus и Torpedo. Показано, что эти каналы очень похожи на каналы концевых пластинок как в структурном, так и в функциональном отношении. Гибридные белки, состоящие из субъединиц рецепторов из электрического органа Torpedo и нервио-мышечиого соединения быка, оказались полностью функциональными.
Выделенный и очищенный nAChR-канал состоит из пяти полипептидных субъединиц четырех разных типов со стехиометрией а208у. Две копии а-субъединиц, присутствующие в комплексе, по всей вероятности, выполняют разные функции. Субъединицы близки друг к другу по аминокислотной последовательности и различаются по кажущейся молекулярной массе. Все субъединицы фосфорилированы и гликозилированы, а к двум, а и /3, ковалентно присоединен липид.
На основе электронно-микроскопических методов реконструкции изображения была построена модель канала, приведенная на рис. 8.8. Метод негативного контрастирования ясно показыва-
ет, что канал имеет центральное отверстие диаметром 30 А с внеклеточного конца и значительно более узкое с ци-топлазматической стороны. На фотографиях четко видна пентамер-ная структура комплекса. Это означает, что пять субъединиц организованы вокруг центральной поры. Использование реагентов, образующих поперечные сшивки, показывает, что субъединицы расположены в следующей последовательности: /3--а--6--у--а, так что а-субъединицы не соседствуют друг с другом. По данным многочисленных исследований, места связывания ацетилхолина, других агонистов и конкурентных антагонистов располагаются на а-субъединицах. Следовательно, существуют два места связывания для этих химических агентов. Антагонисты препятствуют активации, вызываемой агонистами, или путем прямой конкуренции за связывание с теми же участками, или за счет связывания с каким-либо другим местом и, возможно, взаимодействия с каналом per se.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
