Несколько про- и эукариотических ионпереносящих АТРаз составляют единое семейство и обладают сходными аминокислотными последовательностями и механизмами переноса ионов. Наиболее полно охарактеризованы Na + /K+-ATPa3a из плазматической мембраны животных клеток и Са2 + -АТРаза из сар-коплазматического ретикулума. Большинство ферментов этой группы представляют собой единый полипептид с мол. массой 100 000; исключение составляет Na +/К +-АТРаза, выделенная из нескольких источников, которая содержит вторую, меньшую субъединицу с неизвестной функцией. Эти переносчики ингиби-руются ванадатом и прямо фосфорилируются АТР с образованием фосфорилированного интермедидата, играющего важную роль в транспорте. Катионные переносчики этой группы значительно различаются по ионной специфичности. Неодинакова и стехиометрия транспорта. Например, Са2 +-АТРаза переносит 2Са2 + /АТР в полость саркоплазматического ретикулума, в то время как Na+/К +-АТРаза переносит 3Na+ наружу и 2К + в цитоплазму через плазматическую мембрану. При этом различия в работе АТРазы касаются не только стехиометрии и природы переносимых ионов, но также и того, что Са2 + -АТРаза способна переносить ионы лишь в одном направлении, в то время как Na + /K+-АТРаза делает это в обоих направлениях.
Название «фермент Е1Е2-ТИГЩ» было введено в работе, посвященной Na +/К +-АТРазе. Как показали исследования, этот белок существует по меньшей мере в двух различающихся конформациях, для которых характерны разное связывание субстратов и неодинаковая подверженность мягкому протеолизу. Форма Е, соответствует конформации, в которой места связывания ионов обращены в сторону цитоплазмы и которая обладает высоким сродством к АТР. Места связывания ионов в фосфорилированной форме Е2 обращены наружу. На рис. 8.12 изображен транспортный цикл, в котором участвуют две ненагруженные формы переносчика и две нагруженные, Е2 CBCM3, со «спрятанными» внутри насосного комплекса ионами. Изучение связывания К + фосфорилированной формой переносчика показало, что оно происходит в двух разных местах.
Отметим основные особенности каталитического цикла.
Ei-форма связывает три иона Na+ с цитоплазматической стороны мембраны и затем взаимодействует с АТР, образуя фосфори-лированный фермент. Фосфорилируется при этом специфический ас-партат, консервативный в этой группе ферментов.
После отсоединения ADP ионы оказываются «спрятанными» внутри комплекса.
Фосфорилирование белка стабилизирует конформацию с низким сродством к Na +; при этом места связывания ионов обращены наружу. Это способствует переходу Ei-P -» Ег-Р, в результате которого и осуществляется перенос.
В форме Ег-Р места связывания ионов обращены во внеклеточную среду; эта конформация обладает высоким сродством к К+, который связывается, катализирует дефосфорилирование и остается «спрятанным» внутри комплекса. Обратите внимание, что Na+ необходим для быстрого фосфорилирования, а К+ -- для быстрого дефосфорилирования. Ванадат связывается с формой Е2, возможно, как некий аналог переходного состояния фосфата. У других ферментов Е^г-типа, например Са2 + -АТРазы, форма Ег-Р дефосфорилируется и переходит в форму Ei, которая в свою очередь переходит в незагруженную форму.
Лимитирующей стадией каталитического цикла является, по всей вероятности, освобождение К+ и переход его из связанного с ферментом состояния в свободное. Этот процесс стимулируется связыванием АТР с сайтом, обладающим низким сродством. Следовательно, АТР выполняет две разные функции, выступая в качестве субстрата и аллостерического эффектора. Сколько мест связывания АТР имеет фермент, пока неясно.
Определена аминокислотная последовательность нескольких АТРаз Е|Е2-типа, включая Na+/К+-АТРазу из не-
скольких источников, Са2 + -АТРазу, Н + -АТРазу из плазматической мембраны дрожжей и Neurospora crassa и К+-АТРазу из S. faecalis. Исходя из профилей гидрофобности, были построены модели, согласно которым эти белковые комплексы содержат 6, 8 или 10 трансмембранных а-спиральных сегментов. Некоторые участки полипептидов, в том числе и сегмент; содержащий сайт фосфорилирования, в значительной степени гомологичны. Все белки имеют большую гидрофильную петлю, содержащую домены, с которыми, по всей вероятности, связываются нуклеотиды и где происходит фосфори-лирование.
У Са2 * -АТРазы один расщепляемый трипсином сайт, чувствительный к конформационному переходу Е| -¦ Ег, находится в «трансдукционном» домене. Исследовалось также связывание Са2+ с ферментом; было высказано предположение, что транспорту Са2+ предшествует связывание двух ионов Са2+ с определенными участками внутри белкового комплекса. По всей вероятности, у Са2 + -АТРазы места связывания Са2 + с высоким сродством располагаются на значительном удалении от места связывания нуклеотидов, однако эту гипотезу нужно еще проверить. Основные особенности строения Са2 +-АТРазы, представленные на рис. 8.13, согласуются с данными электронной микроскопии, согласно которым этот белковый комплекс сильно выступает из бислоя в цитоплазму. Вероятно, в условиях in vivo АТРазы Е|Ег-типа агрегируют, образуя по меньшей мере димеры, но подтвердить данное предположение экспериментально очень трудно. Тем не менее очевидно, что мономеры также способны к катализу, по крайней мере в некоторых случаях.
Определена аминокислотная последовательность меньшей @-субъединицы Na +/К +-АТРазы. Было высказано предположение, что эта субъединица имеет одну или четыре трансмембранные а-спирали.
В заключение отметим, что благодаря легкости клонирования этих мембранных АТРаз и возможности использования разных экспериментальных подходов эти системы являются отличным объектом для применения к ним направленного мутагенеза и других генетических методов. Подобные методы уже применяются в исследованиях FiFo-АТРаз.
АТРазы Fq-ТИПА ИЗ МИТОХОНДРИЙ, ХЛОРОПЛАСТОВ И БАКТЕРИИ
Большинство бактерий, а также митохондрии и хлоропласты содержат родственные АТРазы FiFo-типа, которые используют трансмембранный протонный электрохимический градиент для синтеза АТР из ADP и неорганического фосфата. В физиологических условиях эти ферменты являются АТР-синтазами. Они содержат от 8 до 13 различных субъединиц и, таким образом, являются гораздо более сложными структурами, чем АТРазы EiE2-THna из плазматических мембран. АТРазы FiFo-типа состоят из двух частей: 1) гидрофильного глобулярного Fi-комплекса, содержащего места связывания нуклеотидов и функционирующего в качестве АТРазы, и 2) мембраносвязанного Fo-kom-плекса, который функционирует как Н+-проводящий канал. F|- и Fo-комплексы могут отсоединяться друг от друга, а после очистки их можно реконструировать с восстановлением функциональной активности.
Fi-комплекс из Е. coli содержит пять субъединиц в стехиометрии m/Sj-yot. Между тремя парами а$ в составе Fi наблюдается асимметрия, возникающая, по всей вероятности, в результате асимметричиых взаимодействий с другими субъединицами. В составе каждого комплекса имеется по три каталитических центра, и для быстрого оборота фермента необходимо, чтобы АТР был связан более чем с одним местом связывания. Для объяснения механизма катализа были построены различные модели с чередованием мест связывания, в частности модель, согласно которой в ходе катализа происходит физическое вращение частей фермента. Возможно, в связывании Fi- и Fo-компонентов фермента в мембране участвуют 5- и е-субъединицы.
Fo-комплекс из фермента Е. coli устроен достаточно просто, он содержит только три субъединицы в стехиометрии а\ЬгСю. Все эти субъединицы необходимы для формирования Н+ -проводящего канала. Полагают, что Н + -проводящая часть Fo образована а-спиралями из множественных копий с-субъедииицы. По всей вероятности, эта субъединица содержит пять трансмембранных а-спиралей, в то время как а- и Ь-субъединицы -- по одной. Результаты, полученные с помощью генетических методов, согласуются с предположением, согласно которому погруженные в мембрану части всех трех субъединиц играют важную роль в обеспечении протонной проводимости.
Изучение этой системы показывает нам, сколь успешным может быть применение генетических методов для исследования строения мембранных белков, для которых отсутствуют кристаллографические данные высокого разрешения. Очень важно выяснить, приводит ли замена единственной аминокислоты в таком белке к конфор-мационным изменениям, которые скажутся на катализе. По-видимому, результат такой замены сильно зависит от природы переносчика. Например, как мы уже обсуждали, очень обнадеживающими в этом отношении являются данные, полученные для лактоэопермеазы. Очевидно, в следующем десятилетии в изучении взаимосвязи между структурой и функцией мембранных белков главную роль будут играть различные генетические методы, в частности направленный мутагенез.
Рассмотрим результаты, прлученные к настоящему времени для FiFo-АТРазы из Е. coli.
Наличие многочисленных мутантных по Ј-субъединице форм позволяет идентифицировать участок, являющийся, по всей вероятности, каталитическим нуклеотидсвязывающим доменом. Исследование мутантных форм показало также, что между а- и /3-субъединицами имеется конформационное сопряжение.
Показано, что мутантные по е-субъединице формы неспособны к сопряжению транспорта Н + с катализируемой комплексом Fi АТРазной активностью, а также к связыванию комплексов F, и Fo.
3. Показано, что определенные аминокислотные остатки в субъединицах а, Ь и с опосредуют протонную проницаемость; имеющиеся генетические данные позволяют предположить, что субъединица b непосредственно контактирует в мембране с субъединицами а и с.
Связаны ли все эти явления с локальными или глобальными конформационными изменениями, покажут дальнейшие исследования. Пока же мы не может сказать определенно, как происходит сопряжение гидролиза АТР и транспорта Н+ при работе АТРазы FiFo-типа, а также с чем связана протонная проводимость.
Важными в этом отношении могут оказаться данные о том, что цитоплазматическая мембрана анаэробной бактерии Propionigenium modestum содержит Na+-зависимую АТРазу FiF^vrHna. Если этот фермент работает как первичный АТР-зависимый Na+-насос, то логично предположить, что механизм функционирования Н+ -АТРазы и Na +-АТРазы одинаков. Например, это позволит исключить модели прямого сопряжения.
ТРИ ДРУГИХ КЛАССА ПЕРЕНОСЧИКОВ
Помимо АТР-зависимых активных переносчиков Е1Е2- и F|Fo-типов есть еще три класса активных переносчиков, использующих свободную энергию гидролиза макроэргических фосфатных связей. О реальных механизмах транспорта или сопряжения в этих системах известно немного. Отметим несколько интересных их особенностей.
1. Бактериальные фосфотрансферазы. Этот комплекс был обнаружен только в бактериях; он катализирует транспорт Сахаров, таких, как глюкоза и маннитол. Уникальной особенностью этой системы является то, что транспорт сахара сопровождается его фосфорилированием. Получаемое фосфатное производное сахара уже не может служить субстратом для переносчика в бактериальной мембране, и таким образом предотвращается обратный поток сахара через эту систему. Вспомним, что в переносчиках EiE2-THna фосфорилирование переносчика стабилизирует форму с низким сродством к переносимому веществу, что также препятствует обратному переносу транспортируемых веществ.
Конечным донором фосфата в фосфотрансферазной системе является фосфоенолпируват. Фосфат переносится специфической последовательностью растворимых фосфорилированных интермедиа-тов в цитоплазму к мембраносвязанному транспортному белку, называемому фермент II или ЕИ. Существует группа ферментов ЕП-типа, специфичных к разным сахарам, но обладающих сходной первичной структурой. По всей вероятности, внутри мембраны ферменты ЕП-типа образуют димеры. Высказывалось предположение, что они формируют каналы. Эти белки чувствительны к реагентам, действующим на сульфгидрильные группы, и к окислению, что может играть важную роль в условиях in vivo. Немного известно о том, каким образом фосфорилированные ферменты ЕП-типа осуществляют транспорт и фосфорилирование Сахаров. Разумной представляется модифицированная модель с чередованием конформации и единственным местом связывания.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
