Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе

3

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.Г. БЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

ФИРСТОВА Наталья Вадимовна

ВЛИЯНИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ОРГАНОВ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОМ СТРЕССЕ

03.00.04 - Биохимия

Диссертация на соискание

ученой степени кандидата

биологических наук

Научный руководитель

кандидат биологических наук

профессор Генгин М.Т.

ПЕНЗА - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

1.1. Опиоидные пептиды и физиолого-биохимические аспекты их действия……………………………………………………...…………………11

1.2. Обмен регуляторных пептидов ………………………………..………..18

1.2.1. Биогенез нейропептидов………….......................................……….18

1.2.2. Механизмы регуляции активности ферментов обмена нейропептидов..………………………………………….…………..………..30

1.3. Опиоидные пептиды при воздействии стрессорных факторов..……...34

1.4. Ферменты обмена нейропептидов при стрессе………………….......…41

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…….…………48

2.1. Материалы исследования……………………………………..………....48

2.2. Методы исследования………………………………………..…………..49

2.2.1. Схема введения предшественника лей-энкефалина ……………...49

2.2.2. Моделирование острого эмоционально-болевого стресса……….49

2.2.3. Метод определения активности карбоксипептидазы Н……..……50

2.2.4. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы……………………………………………....……...…51

2.2.5. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента………………………………………………………………...…….51

2.2.6. Методы определения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro…………………………...……...……………………..……..52

2.2.7. Метод определения белка по Лоури………………..…...…………52

2.2.8. Статистическая обработка результатов исследования...………….52

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….………….53

3.1. Региональное и тканевое распределение КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у самцов крыс..……………………………...…………………....53

3.1.1. Распределение активности КПН………………….……………...…53

3.1.2. Распределение активности АПФ………………………….………...54

3.1.3. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП ……...…...55

3.2. Исследование влияния острого эмоционально-болевого стресса на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФ……56

3.2.1. Активность КПН в головном мозге надпочечниках и семенни-ках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса…….57

3.2.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса ……………..……………………………………..…....60

3.2.3 Активность АПФ в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса ……....62

3.3. Исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ…..………………... 65

3.3.1. Активность КПН в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг…………………………………...67

3.3.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалинарг..……69

3.3.3. Активность АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг……………….……...………...…72

3.4. Исследование влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro…………………..………………..…..74

3.5. Исследование влияние лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФ у крыс на фоне острого эмоционально-болевого стресса..........…..………...………………..…...75

3.5.1. Активность КПН при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса..…..…………………………………....77

3.5.2. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса……………………………………………………………………....80

3.5.3. Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса………........…………….………………84

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ…………88

ВЫВОДЫ……………………..…………………………………………...…114

ЛИТЕРАТУРА………………………………..………………………...…....116

ПРИЛОЖЕНИЕ…………….…………..…………………………...…….....146

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АПФ- ангиотензинпревращающий фермент

ГГНС- гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГГБ- гисто-гематический барьер

ГЭБ- гемато-энцефалический барьер

ГЭМЯК - гуанидилэтилмеркаптоянтарная кислота

КП - карбоксипептидаза

КПН - карбоксипептидаза Н

ПВДС (ДСИП) - пептид, вызывающий дельта сон (дельта-сон инду-

цирующий пептид)

САС- симпато- адреналовая система

ФМСФ- фенилметилсульфонилфторид

ЭБС- эмоционально-болевой стресс

Одной из наиболее актуальных проблем современной биологии и медицины является исследование влияния острых стресс-факторов на организм. Особый интерес вызывает изучение молекулярных механизмов возникновения и развития стресса. Известно, что кратковременное острое стрессирование приводит к экстренной и генерализованной активации ряда физиологических систем, участвующих как в процессах развития (стресс-реализующие), так и в процессах торможения (стресс-лимитирующие) стресс-реакции [4, 5, 21, 29, 33, 116, 121, 125, 144, 145]. Ведущая роль в регуляции функций этих систем принадлежит нейропептидам, веществам, выступающим в организме в роли нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов [126, 134, 204, 221, 258]. В ответ на стресс в первую очередь вовлекаются пептиды гипофиза: адренокортикотропин (АКТГ), -эндорфин, пролактин [136]. Важную роль в адаптации организма к стрессу играют эндогенные биологически активные пептиды - компоненты стресс-лимитирующих систем: вещество Р, пептид, вызывающий дельта сон, энкефалины [27, 28, 69, 107, 110, 135, 152, 241]. Одной из наиболее универсальных стресс-лимитирующих систем, обеспечивающих адаптацию к изменениям, вызванным реакцией на действие экстремального фактора, является система эндогенных опиоидных пептидов [14, 103, 104, 116, 125, 266]. Выраженным антистрессорным действием обладают, в частности, энкефалины [23, 69, 134, 140, 266]. Установлено, что при воздействии стресса содержание опиоидов в структурах мозга, крови и ликворе животных увеличивается [33, 34, 140, 243].

Уровень биологически активных пептидов, а, следовательно, и степень реализации ответной реакции физиологических и биохимических систем на воздействие стресс-фактора в значительной мере определяется активностью пептидгидролаз - ферментов, участвующих в образовании и/или деградации молекул регуляторных пептидов [20, 40, 71, 193, 209, 212, 218, 241, 256, 262].

Нейропептиды синтезируются в организме в виде неактивных высокомолекулярных предшественников. На заключительных этапах процессинга регуляторных пептидов, приводящих к образованию их активных форм, принимают участие карбоксипептидазо-Б-подобные ферменты, катализирующие отщепление остатков основных аминокислот - аргинина и лизина - с С-конца предшественников биологически активных пептидов [39, 188, 192, 264, 268]. Одним из основных ферментов генеза таких нейропептидов как энкефалины, вещество Р, АКТГ, окситоцин, вазопрессин является карбоксипептидаза Н (КПН) (Кф 3.4.17.10) [39, 40, 63, 68, 192, 264]. Недавно появились сведения об участии в обмене регуляторных пептидов фермента, активность которого ингибируется фенилметилсульфонил-фторидом - ФМСФ-ингибируемой КП [49, 53]. Данный фермент обладает сходной с КПН субстратной специфичностью, что же касается биологической роли фермента, то этот вопрос до сих пор остается открытым. Известно, что уровень активных форм энкефалинов и других нейропептидов в организме контролируется также ангиотензинпревращающим ферментом (АПФ) (Кф 3.4.15.1), участвующим как в процессинге, так и в деградации регуляторных пептидов [66, 180, 183, 196, 209, 259]. Однако, несмотря на столь важную роль этих ферментов в организме, многие аспекты проявления их функциональной активности изучены недостаточно. Практически отсутствуют сведения об эндогенных механизмах регуляции активности этих ферментов, а также их свойствах при различных патологических и функциональных состояниях организма.

Одним из видов воздействия, оказывающим влияние на уровень нейропептидов в структурах мозга и периферических тканях и приводящим к экстренному повышению адаптивных способностей организма животного, является острый эмоционально-болевой стресс (ЭБС) [37, 52, 70, 112, 145]. Увеличение синтеза и секреции многих регуляторных пептидов при развитии стресс-реакции, наряду с инициацией ряда адаптационных механизмов, приводит к истощению нейрогуморальных и ферментативных систем. В связи с этим, одной из наиболее актуальных задач функциональной биохимии и медицины является поиск путей коррекции изменений, возникающих в функционировании ряда физиологических систем при воздействии острых стресс-факторов. Наиболее благоприятным способом устранения и/или ограничения стресс-нарушений является искусственное повышение активности эндогенных стресс-лимитирующих систем за счет экзогенного введения стресс-протективных веществ пептидной природы, в частности энкефалинов [69, 116, 135]. Известно, что выраженным адаптогенным действием обладает предшественник лей-энкефалина - лей5-энкефалин-арг6 [69, 135] Введение извне компонентов стресс-лимитирующих систем способствует не только усилению потенциальных возможностей организма, но и инициации синтеза ряда биологически активных веществ, которые также обладают антистрессорным действием [11, 13, 59, 78, 107, 119, 132].

Одной из основных причин, ограничивающих широкое применение веществ пептидной природы в клинической практике при разного рода стресс-повреждениях, является трудность при прохождении ими гистогематических барьеров (ГГБ), в частности гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) [30, 108]. Показано, что при периферическом введении веществ модуляторного типа, наблюдается общая закономерность: сами вещества не проходят ГЭБ, в то время как их ближайшие предшественники хорошо проникают через гемато-энцефалический барьер и вызывают соответствующие изменения в функционировании физиологических систем [82]. Кроме того, большое значение имеет выбор способа введения исследуемого стресс-протективного вещества. Известно, что одним из наиболее благоприятных способов введения веществ является инстилляция на конъюнктиву глаза [1, 119], поскольку такое введение способствует максимальному проникновению вещества в мозг и практически не травмирует животное.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20